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        公司公告

        恭喜!天昊16S擴增子助力益生菌腎病治療研究登陸一區Top雜志《Circulation Research》(IF 23.213)

        發稿時間:2022-10-08來源:天昊生物

        英文題目:Faecalibacterium Prausnitzii Attenuates CKD via Butyrate-Renal GPR43 Axis

        中文題目:普拉梭菌通過丁酸-腎GPR43軸減輕慢性腎病

        期刊名稱:Circulation Research

        發表日期:2022-9-27

        影響因子:23.213 (一區Top)


        慢性腎臟病(CKD)是世界范圍內最重要的公共衛生問題之一,由于其在疾病早期沒有癥狀,對CKD的預防或治療仍具挑戰。由于目前治療CKD僅限于透析和腎移植,成本高昂,急需發展新的更優的治療方法。

        最新研究表明,腸道菌群在CKD的發生發展中發揮著重要作用,但對于特定的腸道菌群及其代謝物是否可以作為CKD的潛在治療藥物仍存疑問。普拉梭菌(Faecalibacterium Prausnitzii)是一種產丁酸鹽的有益細菌,具有促進腸道內環境穩定的抗炎特性,但沒有報道對普拉梭菌是否是CKD的原因或影響進行研究。因此,本研究旨在首先確定在代表西半球和東半球患者的CKD人群中是否持續缺少普拉梭菌。進一步評估補充普拉梭菌是否能夠改善腎功能,并對其可能機制進行探討。


        本實驗利用美國腸道項目(PRJNA797660)測序數據,以及利用天昊生物16S擴增子測序服務,對105名中國獨立人群(包括30名健康志愿者、32名臨床診斷為無高血壓的CKD患者和43名患有高血壓的CKD患者(CKD-HTN))進行了糞便16S擴增子檢測,分析腸道菌群多樣性。還利用GC-MS對血漿和糞便中的短鏈脂肪酸(SCFAs)水平及一系列毒素進行了測定。

        本研究通過對小鼠腎臟顯微注射腺相關病毒構建了動物模型,并通過補充普拉梭菌來研究其對CKD小鼠腸道菌群、SCFAs及對丁酸鹽受體GPR的影響。


        美國CKD人群中糞桿菌屬(Faecalibacterium)的減少

        研究首先比較了來自美國腸道計劃項目中的283名CKD患者和294名非CKD患者(non-CKD)的腸道微生物16S擴增子數據,發現糞桿菌屬在非CKD中富集(圖1A),類桿菌屬(Bacteroides)在CKD中富集(圖1B)。

        中國CKD人群中的菌群失調和糞桿菌屬的減少

        本研究對105名中國的獨立人群進行了糞便16S擴增子檢測,其中包括30名健康志愿者、32名臨床診斷為無高血壓的CKD患者和43名患有高血壓的CKD患者(CKD-HTN)。結果同樣發現,糞桿菌屬在健康對照組中富集,而在CKD-HTN組中顯著減少(圖1C),以及CKD和CKD-HTN中類桿菌的豐度增加(圖1D)。與健康對照組相比,CKD-HTN患者的F/B(厚壁菌門/擬桿菌門)比值較高,這是腸道生態失調的一個特征(圖1E)。與健康對照組相比,CKD和CKD-HTN患者α多樣性的參數(即觀察到的特征、Chao1豐富度和Shannon多樣性)較低(圖1F-1H)。

        圖1、美國腸道計劃數據庫和中國CKD人群中糞桿菌屬較少。


        糞桿菌屬與CKD相關臨床特征呈現負相關

        為了研究腸道菌群的變化是否與CKD的臨床特征相關,本研究使用Spearman評估了多種菌屬豐度與收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、尿酸(UA)、估計的腎小球濾過率(eGFR)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)以及低密度脂蛋白(LDL)之間的相關性,發現糞桿菌屬與UA、BUN、Scr和LDL呈負相關,與eGFR、TC和HDL呈正相關(圖2A),這些表明糞桿菌屬在腎功能中的作用。

        CKD患者血清中短鏈脂肪酸降低(SCFAs),脂多糖和三甲胺N-氧化物升高

        由于腸-腎軸在高血壓和CKD中的重要作用,本研究對幾種微生物群衍生代謝物的血清水平進行了分析。三甲胺N-氧化物(TMAO)是一種通過腸道微生物代謝從膳食磷脂酰膽堿或肉堿產生的分子,在CKD-HTN中明顯高于CKD和對照組(圖2B)。在CKD-HTN患者的血清中,脂多糖(LPSc,一種革蘭氏陰性菌的內毒素)的水平最高(圖2C)。丁酸鹽是糞桿菌屬產生的一種主要代謝產物,在CKD和CKD-HTN中均有所減少(圖2D)。此外,CKD和CKD-HTN患者的乙酸鹽水平降低(圖2E)。與對照組相比,在CKD-HTN組中發現丙酸鹽較少(圖2F)。

        圖2、中國人群3組中的菌屬與臨床特征相關性分析。

        普拉梭菌改善CKD小鼠的腎功能障礙和纖維化

        通過上述實驗,研究者假設補充普拉梭菌這個糞桿菌屬中唯一菌種,將可能改善CKD小鼠動物模型中CKD相關的病理生理學指標。因此,實驗通過5/6 Nx手術在小鼠中誘導CKD 4周,隨后每周3次用200μL 2×108 CFU的普拉梭菌或對照PBS進行灌胃,持續16周(圖3A)。與假手術組相比,CKD組表現出BUN(圖3B)和Scr(圖3C)水平升高。此外病理染色等實驗也表明,與對照組相比,普拉梭菌治療減輕了CKD的病理進展。

        圖3、普拉梭菌(FP)改善了CKD小鼠的腎功能障礙和纖維化。


        普拉梭菌減輕CKD小鼠腎巨噬細胞浸潤和炎癥和減少了CKD小鼠循環尿毒癥毒素

        接下來研究發現在CKD小鼠中觀察到巨噬細胞的腎浸潤增加,普拉梭菌治療改善了巨噬細胞浸潤。與此相一致,5/6 Nx誘導的CKD小鼠腎皮質中Mcpt1、Il1b和Il6的上調mRNA水平通過普拉梭菌治療得到部分緩解。

        本研究還通過測定3種微生物來源的毒素(對甲酚硫酸鹽PCS、對甲酚硫酸鹽IS和三甲胺N-氧化物TMAO)和3種非微生物依賴性尿毒癥毒素(不對稱二甲基精氨酸ADMA、對稱二甲基精氨酸SDMA和胍基琥珀酸(GSA))的水平,證明普拉梭菌治療可以改善CKD小鼠的循環尿毒癥毒素。


        普拉梭菌改變了CKD小鼠的腸道微生物組成

        本研究接下來檢測了普拉梭菌治療的有益效果是否因改變CKD相關腸道菌群。結果發現,普拉梭菌治療顯著增加了observed features、Chao 1和Shannon多樣性(圖4)。在PCoA中,形成了4個簇,普拉梭菌治療顯著改變了微生物群。在屬的水平上,CKD組中比對照組中的脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)和柯林斯菌屬(Collinsella)更豐富,而糞桿菌和羅氏菌屬(Roseburia)更少。經過16周的治療后,脫硫弧菌屬和柯林斯菌屬的平均豐度下降,并增加了CKD小鼠中羅氏菌屬和糞桿菌屬的平均豐度。這表明普拉梭菌改變了腸道微生物群,使其趨向多樣性和穩態的平衡。

        圖4、普拉梭菌改變了CKD小鼠的腸道微生物組成。(原文圖S3)


        普拉梭菌改善CKD小鼠的腸道炎癥和通透性

        腸道炎癥和屏障損傷的增加有助于慢性腎病的發病機制。因此,本研究分析了普拉梭菌治療對腸道炎癥和通透性的影響。與假手術組相比,CKD誘導CKD組近端結腸的Mcpt1、Il6、Il1b、Tlr2Tlr4的基因表達增加。普拉梭菌治療降低了CKD+FP組近端結腸相關基因的轉錄水平。對于腸通透性,實驗進行了(1)緊密連接蛋白的RT-PCR;(2)口服灌胃FITC-葡聚糖,30天后進行評價它在血漿中的水平;(3)血漿中I-FABP的ELISA等,結果確實發現普拉梭菌可以改善CKD小鼠的腸道炎癥和通透性。

        普拉梭菌對普拉梭菌小鼠血漿和糞便中SCFAs產生的影響

        普拉梭菌是一種可以產生丁酸鹽的菌種。為了闡明普拉梭菌腎保護作用的潛在機制,研究者分析了所有4組小鼠的SCFAs水平。與假手術小鼠相比,在CKD小鼠的糞便和血漿中觀察到較少的丁酸鹽。普拉梭菌增加了糞便和血漿中的丁酸鹽水平。未發現普拉梭菌對乙酸鹽或丙酸鹽的影響。這些結果表明,丁酸鹽產量的增加可能是該菌腎臟保護作用的主要機制。

        普拉梭菌增加CKD小鼠GPR- 43的表達

        為了進一步研究普拉梭菌介導的腎臟保護作用是否是通過丁酸鹽實現的,研究者評估了丁酸鹽受體GPR-43、GPR-109A和GPR-41的表達。Gpr43的基因表達在CKD中較低,但在CKD小鼠的腎組織中被普拉梭菌治療挽救,這表明產生丁酸鹽的普拉梭菌的腎臟保護作用可能是通過丁酸鹽與其受體GPR-43結合的過量有效性。GPR-43的免疫組織化學染色顯示,在CKD小鼠和CKD患者中,GPR-43在腎小管上皮細胞和腎足細胞中表達一致。免疫熒光染色也證實AQP-3(腎小管上皮細胞的標記物)陽性和WT-1(足細胞的標記物)陽性細胞表達GPR-43。


        普拉梭菌通過丁酸鹽-GPR-43途徑減少腎臟炎癥

        接下來,研究在腎小管上皮細胞TCMK-1和腎足細胞MPC-5中建立了脂多糖誘導的炎癥的體外模型,以測試普拉梭菌是否具有腎臟抗炎作用,因為腎臟炎癥是CKD不同階段的標志。在這兩種細胞系中,實驗證實了脂多糖誘導的促炎性Il1bIl6的過表達被普拉梭菌和丁酸鈉的培養上清液所抑制。為了證明GPR-43在普拉梭菌和丁酸鹽介導的腎臟炎癥抑制中的作用,使用siRNA敲除GPR-43,并通過TCMK-1和MPC-5中的Western blot證實(圖6B和6C)。在脂多糖處理的TCMK-1和MPC-5細胞中,GPR-43敲除阻斷了普拉梭菌介導的Il1bIl6 mRNA水平的下調。

        通過GPR-43改善慢性腎病小鼠的腎功能障礙和炎癥

        為了確定普拉梭菌介導的腎臟保護作用是否通過GPR-43,研究者使用攜帶靶向小鼠Gpr43編碼序列的短發夾狀RNA的腺病毒,敲除了小鼠腎臟中的GPR-43(圖5A)。免疫熒光染色證實了腎臟中GPR-43的敲低。如圖5B和5C所示,在CKD小鼠中,GPR-43敲除阻斷了通過普拉梭菌治療降低的BUN和Scr。通過染色實驗也確定相似結果。 GPR-43敲除抑制了通過普拉梭菌治療減輕的腎纖維化(圖7D和7E)和腎小管損傷(圖7D和7F)。腎中GPR-43的敲低阻斷了經普拉梭菌處理后F4/80陽性染色的減少(圖7D和7G)。腎中幾個炎癥基因的mRNA表達減少,包括Mcpt1(圖7H)、Il1b(圖7I)和Il6(圖7J ),也受到GPR-43敲除的抑制。

        圖5、普拉梭菌(FP)通過GPR(G蛋白偶聯受體)-43改善CKD小鼠的腎功能障礙和炎癥。(原文圖7)

        丁酸鹽通過GPR-43改善慢性腎病小鼠的腎功能障礙和炎癥

        為了進一步確定普拉梭菌的有益作用是否是由于腎臟中丁酸鹽和GPR-43信號的增加,研究者使用AAV敲除了GPR-43的表達,并給予CKD小鼠丁酸鈉治療(圖6A)。4周后,通過用AAV載體轉導,腎GPR-43表達被敲低(圖6B和6C)。GPR-43敲除阻斷了CKD小鼠中丁酸鹽介導的BUN(圖6D)和Scr(圖6E)的改善。染色結果也顯示GPR-43敲除抑制通過丁酸鹽治療減輕腎臟的纖維化(圖6F和6G)和腎小管損傷(圖6F和6H)。研究還發現,通過丁酸鹽處理,GPR-43敲除阻斷了腎臟中降低的F4/80陽性染色(圖6F和6I)和Mcpt1(圖6J)、Il1b(圖6K)和Il6(圖6L)的mRNA水平。綜上所述,本研究結果表明,普拉梭菌對腎臟炎癥和功能障礙的保護作用是通過丁酸鹽-GPR-43途徑發揮作用的。

        圖6、丁酸鹽通過GPR (G蛋白偶聯受體)-43改善CKD小鼠的腎功能障礙和炎癥。(原文圖8)


        本研究的重要發現包括:(1)在兩個獨立的人群中驗證了作為標記的普拉梭菌的減少;(2)首次在小鼠模型中證明了普拉梭菌能減輕腎臟炎癥,減少尿毒癥毒素,并延緩CKD的進展;(3)證實在小鼠CKD模型中,普拉梭菌糾正了腸道生態失調,恢復了腸道穩態;和(4)說明普拉梭菌來源的丁酸鹽通過GPR-43發揮腎臟保護作用,這有助于其對CKD的有益作用??紤]到CKD發病率和相關死亡率的全球增長,以及CKD預防和有限治療方案的挑戰,本研究在小鼠中的研究提出了一種利用共生菌普拉梭菌作為益生菌治療CKD的新方法。